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一、斑馬魚魚房的管理
1、人員管理
斑馬魚養(yǎng)殖人員及實驗操作人員崗前接受培訓(xùn)。培訓(xùn)內(nèi)容包括：斑馬魚房設(shè)施的特點、斑馬魚房管理方法及操作規(guī)程等。
2、合理安排各項***的事項
斑馬魚房常用器具需定期******。捕撈斑馬魚的漁具和收集受精卵的濾網(wǎng)需浸泡在***液中，使用前后用清水充分沖洗。使用完畢后放回***液中浸泡。***液需每周更換。玻璃器皿需定期高壓***。其它不適于高壓***的器皿，應(yīng)使用***液******。斑馬魚房墻面和地面需每周使用***液清洗***。
斑馬魚房隔離養(yǎng)殖區(qū)的任何器具在未經(jīng)***處理前不得帶離該區(qū)域。在隔離養(yǎng)殖區(qū)收集的受精卵需經(jīng)過***后方可轉(zhuǎn)移至斑馬魚房內(nèi)部養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖。
3、斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)的維護及保養(yǎng)
金水海洋公司的斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)是一種較為復(fù)雜、價格昂貴的大型貴重儀器，而且需要連續(xù)運轉(zhuǎn)，因此對設(shè)備的維護保養(yǎng)至關(guān)重要。為了保證斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)的正常運行，斑馬魚房管理人員需堅持如下的檢查項目：
3.1、 每天檢查系統(tǒng)運行電壓等參數(shù)是否符合系統(tǒng)運行的要求。
3.2、 檢查紫外燈是否正常工作。
3.3、 檢查系統(tǒng)pH、溫度、電導(dǎo)率及溶氧度是否在規(guī)定范圍內(nèi)。
3.4、 定期清洗各種檢測探頭。
3.5、 每周檢測養(yǎng)殖水中的氨氮含量。
3.6、 每天更換或清洗PP精密過袋
3.7、 每月檢查斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)的控制系統(tǒng)及報警系統(tǒng)的各種開關(guān)、換能器、電池、表頭和保險絲的接觸情況和運行情況，確保機組正常運行。
3.8、 空調(diào)機、排風(fēng)機要經(jīng)常保養(yǎng)。
3.9、 與金水海洋公司建立系統(tǒng)年檢制度，每年對系統(tǒng)做系統(tǒng)***的維護。
4、斑馬魚房巡視制度
每天早晚兩次由專人檢查斑馬魚養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖缸及斑馬魚狀態(tài)。如發(fā)現(xiàn)病死魚需及時處理，并做記錄。
5、物品及養(yǎng)殖耗材的管理
斑馬魚魚房的養(yǎng)殖耗材需統(tǒng)一存放，并建立領(lǐng)用登記制度。同時，為了保證環(huán)境的清潔度，應(yīng)盡量減少人員進出的次數(shù)及保證物品的***、***。物品進入斑馬魚房之前，必需經(jīng)******處理。
二、斑馬魚常規(guī)養(yǎng)殖條件
斑馬魚的健康養(yǎng)殖是開展一切斑馬魚有關(guān)的研究工作的基礎(chǔ)。斑馬魚的實驗室飼養(yǎng)過程中，以下的一些環(huán)境條件對于斑馬魚的存活、健康、和繁殖傳代至關(guān)重要。
1、溫度
斑馬魚是一種小型熱帶淡水魚類，可以耐受比較廣的溫度。***耐受的溫度范圍為6至38?C。一般認為28.5?C是斑馬魚養(yǎng)殖的***適溫度，通常情況下魚房溫度控制設(shè)置在28?C。較高的養(yǎng)殖溫度可能導(dǎo)致水體的溶氧度降低，且造成水體中***的滋生，影響斑馬魚的健康。而過低的養(yǎng)殖溫度會造成斑馬魚的生長發(fā)育放緩，產(chǎn)卵量降低。
2、pH值
水體的pH值對魚類的生長繁殖具有重要的影響。目前，仍然缺乏系統(tǒng)的實驗結(jié)果確定斑馬魚生長繁殖的***pH值。大部分斑馬魚養(yǎng)殖設(shè)備維持水質(zhì)pH值在7.0-8.0左右，這也是大部分淡水魚類生活的pH范圍。斑馬魚相對可耐受一定的堿性環(huán)境，酸性環(huán)境，尤其pH低于6.0會造成斑馬魚死亡。
3、硬度
水的總硬度指水中Ca2+和Mg2+等離子的總濃度。斑馬魚適宜于較高硬度的水，水體硬度超過100mg/L CaCO3有利于斑馬魚的生長繁殖。但是，這種適應(yīng)是有限的。目前，尚沒有系統(tǒng)***的研究不同范圍的硬度條件對斑馬魚生長發(fā)育方面的影響。
4、鹽度
斑馬魚屬淡水魚類，但是能夠耐受很大的鹽度范圍。斑馬魚養(yǎng)殖的適宜鹽度通常為0.25‰。養(yǎng)殖系統(tǒng)的鹽度控制范圍為0.25-0.75‰。養(yǎng)魚水：以約0.06g海鹽加入1L的蒸餾水中（終濃度約60μg/ml），充分溶解即可。
5、溶解氧
溶解氧是魚類養(yǎng)殖中的重要條件參數(shù)。低水平的溶解氧往往會造成養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)魚類的大量死亡。斑馬魚具有較快的新陳代謝速率，因而消耗氧氣的水平也比較高。建議養(yǎng)殖水體的溶解氧水平基本維持或者不低于6.0mg/L （28.0?C），以維持斑馬魚的健康生長和活動。
然而水體溶氧度也不是越高越好。水體內(nèi)通空氣過度，會造成氣體達到和超過飽和濃度，產(chǎn)生大量氣泡，對魚造成致命危害，產(chǎn)生氣泡病。
6、氨氮廢物
養(yǎng)殖水體中的氨主要來源于魚的腮上皮組織釋放和糞便排放。含氮廢物的主要來源是水體中的有機物（如死魚，糞便，漂浮食物）的降解。較高的氨氮濃度對魚類有毒害作用，同時也會造成水體內(nèi)的電導(dǎo)率升高。水體中的硝化***可以將氨氮廢物轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，進而轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，因此對于大型的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，培養(yǎng)和維持水體內(nèi)的硝化***水平對水體健康非常重要。較低濃度的硝酸鹽對魚類基本無害，但是濃度超過200ppm，就可能對斑馬魚的健康造成影響。因此，監(jiān)控水體內(nèi)的氨氮水平，和硝酸鹽濃度對維持一個健康的養(yǎng)殖水系是很重要的。
7、光周期/光照強度
適宜的光周期有利于斑馬魚生長繁殖。斑馬魚在經(jīng)歷暗周期后，光照誘導(dǎo)斑馬魚開始交配產(chǎn)卵，并且交配產(chǎn)卵可以持續(xù)一小時左右。24小時連續(xù)光照可能導(dǎo)致斑馬魚不產(chǎn)卵。
斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)的適宜光周期是14小時的光照周期和10個小時的暗周期。同時，照明系統(tǒng)的漸亮和漸暗可以避免刺激斑馬魚，防止斑馬魚從養(yǎng)殖缸內(nèi)跳出。
斑馬魚養(yǎng)殖的合適光強范圍為水體表面的光強在54-324 lux范圍內(nèi)。光照強度過高會導(dǎo)致水體內(nèi)的藻類大量滋生，影響斑馬魚的健康。魚房內(nèi)燈光太暗，光照不足，會造成斑馬魚的條紋灰暗，活力不足。
8、水質(zhì)調(diào)控
水質(zhì)調(diào)控的基本項目有：鹽度、pH值。保證這些水質(zhì)指標都控制在養(yǎng)殖對象的適應(yīng)范圍內(nèi)。一般要求斑馬魚養(yǎng)殖水體的pH值在7-8之間，電導(dǎo)率在500-800μS/cm。金水海洋公司有專門的調(diào)控系統(tǒng)對于以上指標應(yīng)能夠?qū)崟r自動監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)某個指標異常，即時自動調(diào)整。
三、斑馬魚的飼養(yǎng)和傳代
1、斑馬魚的飼養(yǎng)
斑馬魚的***適生長溫度為28.5?C。受精卵被收集之后，5天之內(nèi)的胚胎可在培養(yǎng)皿內(nèi)靜水培養(yǎng)?？梢允褂闷胀B(yǎng)魚水或者胚胎培養(yǎng)基，置于28.5?C恒溫溫箱內(nèi)，每天換水，培養(yǎng)密度不宜超過每個培養(yǎng)皿（90mm）50個胚胎。斑馬魚胚胎在5天之內(nèi)不需喂食。
5到15天的幼苗，可以轉(zhuǎn)移到大的培養(yǎng)器皿中繼續(xù)靜水培養(yǎng)。1L體積內(nèi)不宜放置超過100尾幼苗。每天需要更換至少50%體積的水。可在培養(yǎng)用水或溶液中加入1/10000體積的亞甲基藍，抑制霉菌生長。斑馬魚的幼苗在出生后第5天開口進食，在此階段及時提供食物可以促進斑馬魚幼苗的成活率。斑馬魚幼苗常見的食物是新鮮孵化的草履蟲（paramecia）或者輪蟲（rotifer）。每天喂食2-3次。
15天以上的幼苗，可以開始使用滴水法的近似靜水培養(yǎng)，不需繼續(xù)換水。如果條件不具備，需要繼續(xù)靜水喂養(yǎng)，則需要使用更大體積的養(yǎng)殖水，1L體積內(nèi)不宜放置超過30尾幼苗。15天以上的斑馬魚可以開始喂食豐年蝦（artemia，又稱豐年蟲，鹵蟲）的幼蟲，***喂食2-3次。其中12天至15天的幼苗，可以采用草履蟲和豐年蝦混合喂養(yǎng)的方式，讓幼苗適應(yīng)新食物。
30天以上的幼魚，可以開始正常上架，進入水循環(huán)系統(tǒng)。養(yǎng)殖密度以5尾/L為佳。***應(yīng)喂食2-3次豐年蝦的幼蟲，也可搭配喂食固體顆粒飼料。正常喂養(yǎng)的情況下，3個月大的斑馬魚即可性成熟，交配產(chǎn)生下一代。
2、斑馬魚的配魚和魚卵收集
斑馬魚的交配行為需要光周期的生物鐘控制，在每次光周期開始時應(yīng)激進入交配產(chǎn)卵的狀態(tài)。這時候雌雄魚相遇則有可能交配產(chǎn)卵。健康的斑馬魚性成熟后即可開始交配產(chǎn)卵，6個月到18個月大的斑馬魚是生產(chǎn)的高峰期，一對健康的斑馬魚一次交配可產(chǎn)受精卵200枚以上。
配魚時間應(yīng)在需要收集魚卵的前***傍晚。使用配魚專用缸，把內(nèi)缸（底部有漏網(wǎng)）套入外缸之內(nèi)，加入約2/3缸水，用隔板把雌雄魚分開（圖2.3）。每缸按照雌雄魚1:1或者2:1的比例放置魚。密度不宜過高。
圖2.3 建立自然交配和魚卵收集。左側(cè)，配魚樣式，在外缸內(nèi)放置內(nèi)缸，一雌一雄以隔板分開。缸內(nèi)加水2/3或3/4，蓋上缸蓋。右側(cè)，以培養(yǎng)皿收集到的斑馬魚魚卵。
第二天早晨，光周期開始后，可按需要的時間把隔板抽開，讓雌雄魚交配產(chǎn)卵。一般相互接觸后雄魚會追逐雌魚，15分鐘之后雌雄魚開始交配產(chǎn)卵。所產(chǎn)受精卵會從內(nèi)缸底部漏下，進入外缸，避免成魚接觸和吃掉受精卵。每次收集受精卵都可直接將內(nèi)缸拿出，換入另外一個外缸，把原缸內(nèi)的受精卵隨手倒入收集網(wǎng)內(nèi)，用水沖洗到培養(yǎng)皿內(nèi)（圖2.3）。
如果收集受精卵是為進行顯微注射實驗，則可通過設(shè)定抽開隔板時間，控制雌雄魚接觸的方法控制受精卵的年齡，保證收集到同一時期的受精卵。但是光周期開始2小時后，雌魚如果未能接觸到雄魚，則開始消化體內(nèi)未排出的卵，魚卵質(zhì)量開始下降。所以受精卵收集工作應(yīng)盡量在光周期開始后2小時內(nèi)進行。
本節(jié)附錄：
草履蟲培養(yǎng)：將小麥粒干熱***后，加水煮15分鐘，分裝在無菌容器內(nèi)，4?C保存?zhèn)溆谩Ｔ诿?L凈水中加入1g酵母粉，1ml全脂牛奶，1gNaCl，混入約15粒煮熟的麥粒，接入2ml草履蟲種源，靜置培養(yǎng)5-7天左右可用。
豐年蟲培養(yǎng)：在12L水中，加入約300g海鹽，1勺NaHCO3（6-10g），50g豐年蟲卵，通氣培養(yǎng)24小時可用。
斑馬魚的體外受精技術(shù)
斑馬魚作為實驗工具的一大優(yōu)勢是體外受精，精子可凍存，保持較長時間的活力。在常規(guī)的實驗操作中，體外受精也提供自然交配產(chǎn)卵無法完成的幫助。例如在實驗中一次性需要大量的同基因型胚胎，或需要嚴格同一時間受精的同齡魚卵，或魚本身有缺陷無法完成自然交配的過程的情況下，體外受精都可滿足實驗所需胚胎收集要求。
做體外受精之前***，應(yīng)和自然配魚一樣，把雌雄魚在同一缸內(nèi)分隔放置。做體外受精的當(dāng)天早晨，需配制新鮮的Hank’s buffer。
做體外受精，首先收獲精子樣品。以濃度為0.016% 的tricaine麻醉雄魚，用柔軟吸水的紙吸凈魚身上的水分。吸干水分對于取得可長時間保存的精子樣品非常重要，精子遇水則被***，如不能與卵接觸則很快失去活性，所以要盡量吸干魚身上的水分，尤其是泄殖孔（cloaca）周圍的水分，避免水分混入精子樣品。將麻醉好的雄魚固定在海綿墊上，以圓頭或扁頭，表面和邊緣都很光滑的鑷子，輕輕擠壓雄魚的腹部，同時用毛細針吸入乳白色的精子樣品（圖2.4）。將收獲的精子樣品（1-2μl）溶于50μl Hank’s buffer，置于冰上保存。質(zhì)量好的精子樣品在4?C保存的條件下，可保持活性2-3天。
精子樣品準備好后，可以開始收獲未受精魚卵。同樣將雌魚麻醉，并吸干魚身上的水分，置于小號培養(yǎng)皿內(nèi)，用潤濕的手指輕輕按壓雌魚的腹部，得到未受精的魚卵。質(zhì)量好的魚卵為粘稠狀、淡金黃色。收獲的魚卵如果顏色蒼白、或水狀、或內(nèi)部含有絮狀物，則為質(zhì)量差的魚卵或者死卵，無法被正常受精，應(yīng)該棄之不用。收獲到質(zhì)量好的魚卵之后，迅速將混有精子樣品的50μl Hank’s buffer與之混合，然后加入750μl養(yǎng)魚水***精子。室溫放置3-5分鐘后，可加入養(yǎng)魚水至培養(yǎng)皿的2/3體積，將培養(yǎng)皿放入28?C培養(yǎng)箱。體外受精完成。
圖2.4 體外受精實驗，分別收獲精子和卵子。左圖為以毛細針收獲精子的操作，高質(zhì)量的精子樣品為乳白色。右圖為高質(zhì)量的未受精魚卵，為粘稠狀、淡金黃色。（引自：J vis 2009， PMID：19581874）
受精完成后3-5小時，應(yīng)把受精卵與未能受精的卵和死卵分開，單獨放入90mm培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)。如果體外受精的胚胎用于顯微注射，則在卵子和精子混合10分鐘后可開始進行顯微注射實驗。
